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摘 要 探究不同浓度外源ABA对木薯叶片β-胡萝卜素合成途径相关基因的影响。用HPLC测定β-胡萝卜素含量的变化，用qRT-PCR的方法研究木薯胡萝卜素合成途径相关基因的表达水平。喷施20 mg/L外源ABA，木薯叶片β-胡萝卜素含量升高，叶片中涉及类胡萝卜素合成的基因LYCB上调表达，而类胡萝卜素裂解的CCD1基因下调表达。同时，核心酶PSY1与PSY2基因的下调表达与类胡萝卜素含量的变化无关联。而分别采用10 mg/L与80 mg/L浓度喷施后β-胡萝卜素含量均降低，涉及β-胡萝卜素合成通路类胡萝卜素合成相关基因表达水平下降，而经10 mg/L的外源ABA处理催化类胡萝卜素裂解的CCD1基因上调表达。研究表明太低和太高浓度的外源ABA处理木薯叶片导致β-胡萝卜素积累降低，但外源ABA浓度为20 mg/L时能显著提高叶片β-胡萝卜素含量。
关键词 木薯叶片；脱落酸；β-胡萝卜素含量；β-胡萝卜素合成途径； 基因表达
中图分类号 Q78；S533 文献标识码 A
Abstract The effects of different concentrations of exogenous ABA on the genes regarding β-carotene biosynthesis pathways on cassava leaves were investigated. HPLC was used to detect the change of β-carotene content， and RT-PCR method was applied to analyze the change of the gene expression regarding β-carotene biosynthetic pathway. Under the treatment with 20 mg/L of exogenous ABA， β-carotene content increased in cassava leaves， in which LYCB gene， associated with carotenoid synthesis， was up-regulated， and CCD1 gene related with carotenoid cleavage was down-regulated. Meanwhile， the down-regulation of core-enzyme genes PSY1 and PSY2 expressions was no correlation with the change of carotenoid content. The treatments with 10 mg/L and 80 mg/L of exogenous ABA， respectively， resulted in the decrease of β-carotene content in cassava leaves. The genes involved in the carotenoid biosynthetic were down-regulated， and CCD1 gene regarding carotenoid cleavage was up-regulated using 10 mg/L of exogenous ABA. The results showed that the treatments with too low and too high concentrations of exogenous ABA led to the decrease of β-carotene accumulation， however， using 20 mg/L of exogenous ABA could significantly increase the β-carotene content.
Key words Cassava leaves； abscisic acid； β-carotene content； β-carotene synthesis pathway； genes expression
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.04.013
木薯（Manihot esculenta Crantz）为大戟科木薯属植物，与马铃薯和红薯并列世界三大薯类作物；具有高光效和高淀粉积累特性，耐干旱和贫瘠，对环境适应能力强，是世界热区近8亿人的主糧[1-3]。木薯叶片中富含胡萝卜素，而块根缺乏。因此，在非洲等地，长期食用缺乏类胡萝卜素木薯块根容易导致夜盲症的发生，而适当的以木薯叶片为食能够补充缺少类胡萝卜素带来的伤害。前人研究表明，类胡萝卜素合成的直接前体是牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（GGPP）。类胡萝卜素合成起始于两分子GGPP的缩合反应，由八氢番茄红素合成酶（PSY）催化两分子GGPP形成没有颜色的八氢番茄红素。该反应是类胡萝卜素合成的关键限速位点[4]。在植物中PSY通常由多基因编码，不同PSY基因表达具有明显的组织特异性及对不同环境响应的特性。木薯中存在3个PSY基因，其中PSY1和PSY2在植物叶片与块根中表达，而PSY3在木薯中几乎不表达[5]。八氢番茄红素经过脱氢酶（PDS）和异构化酶催化（ZDS）后形成有颜色的番茄红素，在水稻胚乳中脱氢反应也是重要的限速环节[6]。植物中存在两条支流（LYCB和LYCE）控制番茄红素向下转化，使得类胡萝卜素合成途径中出现β和ε两条分支。在β分支中，番茄红素分子的两端被LYCB环化形成β-胡萝卜素；在ε路径中，番茄红素经LYCB和LYCE环化后形成α-胡萝卜素[7]。通过氨基酸序列比对，LYCB和LYCE可能有共同的起源[8]。番茄成熟过程中LCYB基因的下调是导致果实番茄红素积累的原因[9]。在非血红素铁加氧酶类羟化酶（HYD）的作用下，环化后的类胡萝卜素形成β，β-类胡萝卜素[10]。在植物中类胡萝卜素的降解主要是由类胡萝卜素双加氧酶（CDs）完成的，其分为9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶（NECDs）和类胡萝卜素裂解双加氧酶（CCDs）两大类。CCDs是一种类胡萝卜素氧化酶，在特定位点裂解氧化类胡萝卜素。CCD1能够在类胡萝卜素的C9-C10位上剪切番茄红素、胡萝卜素、玉米黄质或脱辅基类胡萝卜素等，从而形成芳香类物质[11]。
脱落酸（Abscisic acid，ABA）是高等植物重要的激素之一，在逆境下如高温、干旱等能够显著降低对叶绿体超微结构的破坏，并诱导某些酶重新合成，增加植物的抗逆性[12-13]。同时，ABA与类胡萝卜素合成途径有着密切的联系。类胡萝卜素是合成ABA的前体物质，ABA的合成不仅受到内源NCED基因表达水平的影响[14]，同时上游类胡萝卜素途径PSY的超量表达也能够增加ABA的含量[15]。在拟南芥中外源ABA处理6 h后许多与ABA合成和分解的基因也受诱导调节[16]。此外，也有研究表明外源喷施ABA能够增加番茄果实与种子的ABA含量[17]。本研究采用不同浓度的外源ABA处理水培生长的木薯植株，探究类胡萝卜素合成途径的相关基因及β-胡萝卜素含量在处理后的变化，揭示外源ABA在木薯叶片类胡萝卜素代谢中的作用，为今后研究木薯类胡萝卜素积累的调控机制提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
供试材料木薯栽培种华南9号（SC9）采自中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所国家木薯种质资源圃。选取粗细均一，长度20 cm的SC9种茎放入干净的塑料杯（杯高15 cm，直径9 cm）中，加入150 mL的自来水，置于常温，进行培养。每间隔3 d更换1次营养液。当水培至40 d后，出现18～25片展开叶，选取叶片长势均一的植株，整株施用外源ABA。实验设计3个ABA浓度，分别为低浓度10 mg/L、中浓度20 mg/L和高浓度80 mg/L，每个浓度处理6株，以喷施清水作为对照。处理6 h后，取出植株，用清水洗净叶片，迅速置于液氮速冻，放置于-80 ℃冰箱中保存备用。
1.2 方法
1.2.1 叶片类胡萝卜素的提取 叶片类胡萝卜素的提取参照Lucia等[18]，称取0.5 g SC9功能叶片液氮碾磨至粉末状，转入10 mL离心管，加入2 mL冷丙酮涡混，再加入2 mL冷冻石油醚涡混。4 ℃，3 000 r/min，离心5 min后取上清液，转入10 mL离心管，剩余残渣加入1 mL石油醚再次涡混、离心，重复抽提3次，直到残渣变成无色，收集的样品液用氮气吹干，加入500 μL丙酮溶解后转入棕色样品瓶中。用YCM Carotenoid S-3柱、30 ℃柱温、甲醇/叔丁基甲醚（70/30， V/V）流动相、1 mL/min流速、20 μL进样量和450 nm测定波长进行HPLC分析。
1.2.2 RNA样品提取 参照TIANGEN RNAprep Pure Plant Kit多糖多酚试剂盒说明书进行木薯SC9功能叶片总RNA提取。
1.2.3 RNA反转录及产物检测 参照TaKaRa公司的PrimeScriptTM RT regant Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time）进行去除基因组及反转录。
1.2.4 目的基因荧光定量分析 依照TaKaRa公司的SYBR Prime Ex Taq试剂的要求进行反应液混合：SYBR Prime Ex TaqⅡ5 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，cDNA模板1 μL，dH2O 3 μL。PCR反应循环条件为：94 ℃ 1.5 min，94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，一共40个循环；绘制溶解曲线。以喷施清水的表达量为1，采用2-ΔΔCt 分析不同处理基因的表达量。每个处理3次生物学重复。木薯持家基因（Actin）[19]；ζ-胡萝卜素脱氢酶基因（ZDS）、八氢番茄红素脱氢酶基因（PDS）、八氢番茄红素合成酶基因（PSY1， PSY2）、β-胡萝卜素羟化酶基因（HYD）、胡萝卜素裂解双加氧酶基因 （CCD1）、番茄红素ε-环化酶基因（LYCE）和番茄红素β-环化酶基因（LYCB）的引物见表1。
1.3 数据分析
使用Excel 2016和SPSS 22.0统计软件对数据进行分析，差异显著分析采用新复极差法（Duncan）和最小显著差异法（LSD）。
2 结果与分析
2.1 木薯SC9功能叶片在外源ABA处理后β-胡萝卜素含量的变化
不同浓度外源ABA处理对木薯SC9功能叶片中类胡萝卜素含量的变化见图1所示。在不同浓度外源ABA处理下，木薯SC9功能叶片β-胡萝卜素含量发生显著性变化。与对照喷施清水相比，喷施10 mg/L ABA，叶片β-胡萝卜素含量显著降低；当外源ABA浓度升高至20 mg/L时，叶片β-胡萝卜素含量显著高于对照；然而随着外源ABA浓度上升至80 mg/L，叶片β-胡萝卜素含量显著下降，结果与喷施ABA 10 mg/L浓度相近。研究表明采用太低和太高濃度的外源ABA处理木薯叶片导致β-胡萝卜素积累降低，但外源ABA浓度为20 mg/L时能显著提高叶片β-胡萝卜素含量。
2.2 类胡萝卜素合成途径相关基因的表达水平分析
采用不同浓度ABA喷施木薯品种SC9叶片，6 h后分析叶片中类胡萝卜素合成途径相关基因表达水平的变化，结果如图2所示，喷施20 mg/L ABA时，PSY1和PSY2基因在叶片的表达水平显著高于10 mg/L与80 mg/L ABA处理的表达水平，但低于清水对照（图2-A、B）。PDS催化类胡萝卜素的脱氢，在外源ABA处理下，其表达水平均受到显著抑制，但喷施20 mg/L ABA的表达水平要高于10 mg/L和80 mg/L处理（图2-C）。ZDS在较低浓度的外源ABA处理（10 mg/L和20 mg/L）时，其表达量显著高于采用高浓度的ABA处理（80 mg/L），但均低于清水对照（图2-D）。而LYCB表达水平在20 mg/L外源ABA处理时达到最高，显著高于清水对照；而经低浓度（10 mg/L）和高浓度（80 mg/L）外源ABA处理后，其表达水平显著性受到抑制（图2-E）。LYCE的表达水平在低浓度（10 mg/L）和高浓度（80 mg/L）外源ABA处理后，均受到显著性抑制；而采用20 mg/L外源ABA处理的表达水平与清水对照没有显著性差异（图2-F）。HYD在不同浓度的外源ABA处理下，其表达水平均受到显著抑制，其中表达水平受到抑制最强的是20 mg/L外源ABA处理，10 mg/L处理次之（图2-G）。CCD1编码的酶能够催化类胡萝卜素的降解，在10 mg/L低浓度外源ABA处理下，其表达水平最高；喷施80 mg/L高浓度ABA，其表达水平与清水对照没有显著差异；但处理浓度为20 mg/L时，CCD1的表达水平最低，说明此时类胡萝卜素降解受到抑制（图2-H）。
3 討论
植物组织中， PSY是八氢番茄红素合成的关键酶，也是决定类胡萝卜素含量的关键限速酶；本研究结果显示不同浓度的外源ABA处理均使木薯叶片PSY1和PSY2基因的表达水平受到抑制，但20 mg/L外源ABA处理对PSY1和PSY2基因表达的抑制最小。前人研究结果表明干旱胁迫虽然也造成木薯叶片PSY1与PSY2基因的表达水平下降，但类胡萝卜素含量并未发生显著变化[5]，推测木薯PSY基因的表达水平并非直接影响叶片类胡萝卜素的含量。不同木薯β-胡萝卜素含量的差异可能是由于PSY基因的单核苷酸多态性造成PSY酶活性变化，进而影响木薯类胡萝卜素含量[20]。PDS、ZDS、LCYB、LCYE和CCD1综合作用影响八氢番茄红素向α/β-胡萝卜素的转化进程，大量研究表明，LCYE和LCYB的转录调控及其编码酶的活性是决定番茄红素分支流量的重要因素[21]。本研究采用20 mg/L外源ABA处理导致PDS和ZDS基因的表达水平低于清水对照，但LCYE基因的表达水平与清水没有显著差异，而LCYB基因的表达水平显著高于清水对照，表明向β-胡萝卜素通路加强；分析催化α/β-胡萝卜素降解的CCD1基因的表达水平，发现采用20 mg/L外源ABA处理，CCD1基因的表达水平与清水对照相比，显著受到抑制；因此通过提高合成途径和降低分解途径相关基因表达水平的综合作用，使得20 mg/L外源ABA处理导致β-胡萝卜素的积累显著高于清水对照（图1）。低浓度（10 mg/L）和高浓度（80 mg/L）外源ABA处理，导致PDS、ZDS、LCYB和LCYE基因的表达水平均低于清水对照；此外，与清水对照相比，低浓度（10 mg/L）外源ABA处理还诱导CCD1基因的表达水平升高，导致α/β-胡萝卜素降解加大，促使α/β-胡萝卜素积累降低。
HYD和NCED是促使α/β-胡萝卜素合成ABA的重要蛋白酶。王淑娟等[22]通过对木薯叶片喷施ABA发现外源ABA对内源ABA含量影响显著，能抑制ABA合成关键酶NCED基因的表达。已有研究表明HYD的表达水平与ABA的含量成正相关[23]，本研究表明喷施外源ABA导致HYD基因表达降低，促使β-胡萝卜素含量的高积累（图1和图2-G）。前人研究表明适中浓度的外源ABA能够提高植物中抗氧化酶的活力并减弱叶片氧化胁迫从而提高类胡萝卜素的含量[24-25]，因此ABA对类胡萝卜素合成有潜在的调控作用[26]。而类胡萝卜素是ABA合成的前体物质，表明外源ABA能够抑制类胡萝卜素向下游的转化，本研究结果也证实了施用外源ABA能够调控木薯叶片中β-胡萝卜素的含量。
类胡萝卜素的合成途径较为复杂，其合成途径相关基因的表达和调控不仅涉及到转录，而且还影响到光调控、转录后的修饰、蛋白质的翻译和编辑等。至于外源ABA是如何进行调控相关基因间的作用机制，需要进一步的研究。
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