摘 要 棉花纤维发育经历起始期、延伸期、次级细胞壁加厚期、脱水期共4个发育时期。为了了解GA负调控因子基因在整个纤维发育时期的调节作用，采用敏感的实时定量PCR对GA负调控因子基因GhRGL在棉花纤维不同发育时期中的转录水平进行了定量研究，通过提取来源于不同纤维发育阶段[包括-3～0 DPA（开花后）胚珠，3 DPA胚珠，5 DPA胚珠，10 DPA胚珠，15 DPA纤维，25 DPA纤维]的样品总RNA，探讨不同发育时期GhRGL基因的表达模式。结果显示，GhRGL基因在所有被选的样品中都有表达，其中在5 DPA胚珠和10 DPA胚珠中转录水平较高， 在10 DPA胚珠中表达水平最高， 在-3～0 DPA胚珠、3 DPA胚珠、15 DPA纤维、25 DPA纤维中的表达水平较低，表明GhRGL基因在纤维伸长期表达水平较高，暗示GhRGL可能对纤维伸长起着重要作用。
關键词 荧光实时定量PCR ；棉花纤维发育 ；GA负调控因子基因 ；表达模式
中图分类号 Q943.2 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.10.009
Analysis of the Expression Pattern of GA Insensitive Regulator Gene
in Cotton Fiber Development by Realtime PCR
YI Xiaoping XIE Xiang LIAO Wenbin
（Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， CATAS， Haikou， Hainan 571101）
Abstract Cotton fibers， which are highly elongated epidermal cells that grow from the seed integument， undergo a developmental process that includes cell fate determination， initiation， elongation， specialization， and finally， programmed cell death. Transcript levels of GhRGL at different stages of cotton fiber development were quantified and analyzed by sensitive and real-time PCR technique to understand the expression pattern of GhRGL gene at all stages of cotton fiber development. Total RNA samples were extracted from different stages of cotton ovules and fibers including -3～0 DPA ovules， 3 DPA ovules， 5 DPA ovules， 10 DPA ovules， 15 DPA fibers， and 25 DPA fibers to analyze the expression pattern of GhRGL gene in cotton fiber development. The results showed that the GhRGL gene was expressed in all selected cotton samples. Higher levels of GhRGL mRNA were detected in 5 DPA and 10 DPA ovules， and the highest levels of GhRGL mRNA were detected in 10 DPA ovules. Lower levels of mRNA were detected in -3～0 DPA ovules， 3 DPA ovules and 15 DPA fibers， and 25 DPA fibers. gene was expressed at the highest levels at the fiber elongation stage， suggesting the important role of GhRGL in cotton fiber elongation.
Keywords realtime PCR ； cotton fiber development ； GA insensitive regulator gene ； expression pattern
GA信号转导途径是通过DELLA蛋白来抑止的。所有的DELLA蛋白都具有以下特征：在N端有高度保守的DELLA结构域和VHYNP结构域[1-2]。在拟南芥基因组中，共有5个高度同源的DELLA蛋白抑止子，包括GA INSENSITIVE （GAI）、REPRESSOR OF ga1-3 （RGA）、RGL1 （RGA-LIKE 1）、RGL2、RGL3[2-3]。GAI和RGA在抑制植物延伸生长时具有重叠的功能，RGA-LIKE1 （RGL1）和RGL2分别在控制植物发芽和花发育中起着重要作用[4-5]。所有的DELLA蛋白均可以通过泛素降解系统进行降解，而不能对GA反应进行抑制[6-7]。
棉花纤维是生长于种子表面的高度延伸的表皮细胞，经历了细胞命运决定期、起始期、延伸期、次级细胞壁加厚期，最终经脱水期后细胞程序死亡[8]。棉花纤维发育至少有一部分是由植物激素控制的[9]。通过胚珠液体体外培养对棉花纤维发育进行分析可知，外源IAA与GA是棉花纤维发育所必需的。笔者前期研究表明，使用GA生物合成抑制剂可抑制棉花纤维的生长，说明GA在启动棉花纤维伸长中起着重要作用。 因此，在前期的研究中，对GA负调控因子基因DELLA基因进行分离研究，对分离的棉花DELLA蛋白进行生物信息学分析，结果显示，该蛋白具有与拟南芥中DELLA蛋白一样的保守结构域。本研究运用QPCR对DELLA蛋白编码基因GhRGL在棉花纤维发育各个时期的表达模式进行了研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 基因来源
GA负调控因子基因GhRGL为本实验室保存。
1.1.2 棉花胚珠来源
棉花胚珠来源于本实验室基地。
1.1.3 仪器和试剂
StepOne Plus实时荧光定量PCR仪；荧光定量PCR试剂盒（SYBR Green）；RNA提取试剂采用华越洋植物RNA试剂盒。反转录试剂盒SuperScript III Reverse Transcriptase购自美国Invitrogen公司；DNA消化酶、DNA Marker及实时定量PCR试剂盒购自大连宝生物工程公司。引物由生工生物工程（上海）有限公司北京分公司合成。
1.2 方法
1.2.1 棉花胚珠RNA提取
棉花RNA提取按Wan等[10]的方法进行。
1.2.2 反转录反应
取5 μL RNA模板进行逆转录反应，仪器为Biometra PCR仪。反应体系如下：5×逆转录buffer 2 μL，下游引物（25 μmol/L）0.5 μL，dNTPs（10 mmol/L）1 μL （上海生工生物工程有限公司），MMLV（10×106 U/ L）1 μL，DEPC水0.5 μL，RNA模板5 μL，总体积为10 μL。反应条件：37 ℃反应1 h，然后95℃反应3 min。
1.2.3 引物及探针
GhRGL在棉花不同组织中的表达模式试验：采用棉花的Histone3基因作为内对照基因，Ghhis3基因和GhRGL基因的定量PCR引物与探针通过网上程序ProbeFinder version （https：///sis/rtpcr/upl/acenter.jsp？id=030000）
进行设计。Ghhis3基因定量PCR的引物：5′-TTCCAGAGGCTTGTTCGTG-3′（正向），5′-TTCCAGAGGCTTGTTCGTG-3′（反向）；探针：罗氏通用探针库#61探针。GhRGL基因定量PCR的引物：5′-CAGCGGCGATGGGTATAG-3′（正向），5′-CTTGTATGCCACCCAAGCAT-3′（反向）；探针：罗氏通用探针库#25探针。
1.2.4 定量PCR条件与定量方法
所有样品总RNA采用RNase-free DNase I（TaKaRa Biotechnology Co.， Ltd.， Dalian） 进行消化以排除基因组DNA的污染；所有样品的cDNAs合成均采用PrimeSriptTM RT reagent Kit（TaKaRa Biotechnology Co.， Ltd.， Dalian）；所有样品的PCR反应均进行3次重复，并且设置了無模板与无反转录的对照；所有样品的定量PCR分析均采用Stratagene Mx3000P QPCR System进行。定量RT-PCR的反应体系为25 μL，包括FastStart Universal Probe Master （ROX） （Roche Ltd.）12.5 μL ，hydrolysis probe 0.25 μL（25 μmol/L），正向引物（50 μmol/L）0.9 μL ， 反向引物（50 μmol/L）0.9 μL，ddH2O 9.45 μL，模板cDNA （5 ng/μL）2 μL。定量PCR的反应条件为：94℃ 10 min， 95℃ 15 s，60℃ 1 min，共进行40个循环。采用MxProTM QPCR Software Version 3.00（STRATAGENE）进行数据收集与分析。定量结果用循环阈值（CT）表示，样品中基因相对表达量的确定参照前人的方法进行。不同样品的CT值由公式ΔCT=CTtarget-CTcontrol计算得到，目标基因与内对照基因的表达差异用2-ΔCT公式确定，每一个样品PCR反应重复3次，3次重复的2 -ΔCT 的平均值被用来确定目标基因与内对照基因的表达差异。
2 结果与分析
2.1 GhRGL基因和蛋白质序列
GhRGL基因序列见图1，GhRGL基因推导出的蛋白质序列见图2。
2.2 GhRGL基因聚类分析
通过序列比较发现，含有完整的GhRGL基因的核酸序列与AtGAI核酸序列的相似性为63.5%，棉花GhRGL蛋白序列与拟南芥中所有的DELLA蛋白（GAI， RGA， RGL1， RGL2 and RGL3）[1]具有高度的相似性，其氨基酸相似度分别为60.5%，59.8%， 63.1%， 61.8%，和58.1% （图3）。DELLA蛋白编码基因事实上属于GRAS家族中的一员，DELLA 蛋白与GRAS家族的其它蛋白在C端具有高度的同源性，但在N端的同源性较差。然而，来源于不同植物的所有DELLA蛋白，在氨基酸序列的N端具有较高的同源性，包括高度保守的DELLA结构域和VHYNP结构域，以及一个多变的Poly S/T结构域。除此之外， 这些蛋白还具有多个保守的结构域，包括一个核定位信号（NLS）， 2个亮氨酸拉链motifs， 以及一个高度保守的GRAS结构域[3]。
2.3 棉花胚珠RNA提取
用于提取RNA的棉花样品包括-3～0 DPA胚珠、3 DPA胚珠、5 DPA胚珠、10 DPA胚珠、15 DPA纤维、25 DPA纤维共6个样品，代表了棉花纤维发育的4个阶段。提取的RNA经电泳检测可知，其完整性好，结构如图4所示。所有RNA样品均用RNase-free DNase I进行处理以消化基因组DNA，反转录产物的第一链合成采用cDNA Synthesis Kit 进行合成。
2.4 定量PCR標准曲线
采用相对定量的方法，对GA负调控因子基因GhRGL在棉花不同纤维发育阶段的表达模式进行研究。采用Ghhis3（棉花组氨酸蛋白基因）作为对照基因，分别对GhRGL和Ghhis3基因进行标准曲线制作。分别将GhRGL和Ghhis3基因稀释成6个梯度，取定量标准模板5 μL于不同的反应管中，在Stratagene Mx3000P QPCR System扩增仪上进行扩增。不同浓度标准的起始模板数具有不同的反应平台期，因而有不同的Ct值，起始模板数与Ct值成正比例增长。因此，根据不同梯度的定量模板数与其对应Ct值的关系取对数拟合作图，便得到定量标准曲线，将样品与标准曲线进行比较，即可对样品进行定量。由图5可见，GhRGL基因的标准品Ct值与起始模板数之间呈线性关系，R=0.989，扩增效率为94.7%；Ghhis3基因的标准品Ct值与起始模板数之间呈线性关系，R=0.999，扩增效率为104.4%，线性关系极好，证实了用Ct值进行定量的准确性。
2.5 GhRGL基因在棉花纤维发育时期的表达模式分析
在棉花纤维发育过程中，胚珠的表皮细胞经历几个特殊而又重叠的步骤，包括纤维起始（-3～0 DPA）、伸长（5～15 DPA）、次级细胞壁合成（15～25 DPA）和成熟（25～45 DPA）， 最后形成成熟的纤维[8]。为了了解GhRGL基因在棉花整个纤维发育时期的表达模式，本研究采用敏感的实时PCR对GhRGL基因在棉花纤维不同发育时期的转录水平进行了定量研究，图6是GhRGL基因与对照基因的扩增曲线。对来源于棉花不同纤维发育阶段的胚珠样品总RNA进行提取，6个来源于不同发育时期的样品总RNA被用来分析GhRGL在棉花纤维中的表达模式，包括-3～0 DPA胚珠、 3 DPA胚珠、5 DPA胚珠、10 DPA胚珠、15 DPA纤维、25 DPA纤维。结果显示，GhRGL基因在所有被选的样品中都有表达，其中在5 DPA胚珠和10 DPA胚珠中有高的表达水平， 在10 DPA胚珠中的表达水平最高， 在 -3～0 DPA胚珠、3 DPA胚珠、15 DPA纤维及25 DPA纤维中的表达水平较低（图7）。由此可见，GhRGL基因在纤维伸长期表达水平高，暗示GhRGL可能对纤维伸长起着重要作用。
3 讨论
GA信号转导是通过DELLA蛋白来抑制的。通过Blast分析可知，本课题组前期从棉花组织中分离了一个DELLA蛋白编码基因GhRGL。本研究利用定量PCR分析了该基因在棉花组织中的表达情况，结果表明GhRGL在纤维伸长阶段具有高水平的表达，即GhRGL基因在5 DPA胚珠和10 DPA胚珠中高水平表达。据文献报道，在拟南芥中，有5个DELLA蛋白，并且这5个DELLA蛋白编码基因在拟南芥中具有不同的表达模式，RGA和GAI基因几乎在所有组织中都有表达，而RGL1、RGL2、RGL3只在发芽的种子或花及荚中有高水平表达[11]。所有这些DELLA蛋白在拟南芥中具有不同的表达模式，表明不同的DELLA蛋白对拟南芥的发育具有不同的调节作用。与拟南芥中的DELLA蛋白类似，在棉花中，可能具有7个不同的DELLA蛋白编码基因（4个RGL2s， 2个GAIs和一个RGL1）[12]。与拟南芥中的DELLA 蛋白类似，棉花中不同的DELLA可能也具有不同的功能，以调节棉花的生长与发育。
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