【摘要】目的探讨急性有机磷中毒（AOPP）患者细胞因子水平与miR-93表达的关联性。方法选取2015年7月至2017年2月收治确诊AOPP的 35例患者作为实验组，选择同期30例健康就诊者作为对照组，对比观察两组患者肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、可溶性血管细胞黏附分子-1（sVCAM-1）、促炎因子白细胞介素-1β（L-1β）和miR-93表达水平。结果实验组TNF-α、sVCAM-1和IL-1β高于对照组（P<0.001），miR-93表达水平低于对照组（P<0.001）。实验组不同年龄miR-93水平均较对照组低（P<0.05或0.01）。miR-93表达与TNF-α、sVCAM-1、IL-1β水平呈负相关，相关系数分别为-0.694、-0.621和-0.665，对应F值分别为74.828、54.065、65.627（均P<0.001）。结论AOPP不同年龄患者的miR-93呈低表达现象，miR-93表达与TNF-α、sVCAM-1和IL-1β水平呈负相关，miR-93或许参与AOPP的病理生理过程。
【关键词】急性有机磷中毒；细胞因子；miR-93
中图分类号：R595.4文獻标识码：ADOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2017.04.006
【Abstract】ObjectiveTo investigate connection between cytokine levels and miR-93 expression in patients with AOPP（acute organophosphorus pesticide poisoning）.Methods35 cases admitted to hospital and confirmed with AOPP from July，2015 to February，2017 were selected as experimental group，and 30 healthy people were selected as control group at the same time.Then，tumor necrosis factor-α（TNF-α），soluble vascular cell adhesion molecule-1（sVCAM-1），proinflammatory cytokines interleukin-1β（L-1β）and miR-93 expression levels were observed and compared between the two groups.ResultsTNF-α，IL-1β and sVCAM-1 of the experimental group were higher than those of the control group（P<0.001），but miR-93 expression level was lower than that of the control group（P<0.001）.The miR-93 levels at different ages in the experimental group were lower than those in the control group（P<0.05 or 0.01）.The miR-93 expression was negatively correlated with TNF-α，sVCAM-1 and IL-1β，and correlation coefficient was -0.694，-0.621，-0.665，respectively，and corresponding F value was 74.828，54.065，and 65.627，respectively（all P<0.001）.ConclusionMiR-93 expression is low in patients with AOPP at different ages，it is negatively correlated with TNF-α，sVCAM-1 and IL-1β.So miR-93 may involve in the pathophysiological process of AOPP.
【Key words】AOPP；cytokines；MiR-93
急性有机磷中毒（Acute organophosphorus pesticide poisoning，AOPP）患者，因各种原因引起有机磷误进入机体后，其磷酰基与乙酰胆碱酶的活性部分结合成磷酰化胆碱酯酶，后者不能分解乙酰胆碱，患者体内乙酰胆碱异常升高，其胆碱能神经过度兴奋，最后转入抑制和衰竭，出现临床症状和体征[1]。AOPP患者的症状和转归与其机体的某些炎症代谢异常有关[2]，患者的内皮功能受损，巨噬细胞被活化，引起多种细胞因子的释放[3]。miRNA与疾病的发生发展有关， miRNA-93通过调节某些炎症因子的表达水平，从而影响患者对疾病的抵御反应，但其机制还需进一步研究[4]。为了解AOPP患者miR-93和炎症因子表达水平的关联性，我们检测35例AOPP患者肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、可溶性血管细胞黏附分子-1（sVCAM-1）、促炎因子白细胞介素-1β（L-1β）和miR-93表达水平，并与30例健康者比较，总结报告如下。
1对象与方法
1.1研究对象选取2015年7月至2017年2月本院收治符合AOPP诊断标准的 35例患者进入实验组，男13例，女22例，年龄25～30（27.5±1.5）岁；选择同期30例健康就诊者作为对照组，男11例，女19例，年龄25～30（27.8±1.4）岁。两组入选者均排除心、肝、脑、肾、肺疾患及代谢性疾病、高血压和自身免疫性疾病，性别、年龄比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
1.2AOPP病例入选标准（1）有有机磷农药接触史；（2）参照《职业性急性有机磷农药中毒的诊断及处理原则》（GB 7794-87），根据短时间接触大量有机磷的职业史，在24小时内出现头晕、头痛、恶心、呕吐、多汗、胸闷、视力模糊、无力等症状，瞳孔可能缩小，结合全血胆碱酯酶活性在50%～70%，参考作业环境的劳动卫生调查资料和皮肤污染情况，进行综合分析，排除其他疾病后，确诊为AOPP轻度中毒者，血清胆碱酯酶活力持续降低。
1.3实验方法参加实验者事先知道本项实验的方法、目的和意义，征得受试者同意并签署知情同意书后成为观察对象。
1.3.1TNF-α、sVCAM-1的检测受试者于清晨采血，采血前夜22：00后禁食，于早上6：00～7：00抽取静脉血，第一管用EDTA抗凝管。取血2 ml，20～30 min内室温下以3000 r/min，离心10 min分离血清，TNF-α、sVCAM-1的检测采用ELISA双抗体夹心法，试剂分别由武汉博士德公司、法国IMMUNOTECH公司、福建迈特生物工程有限公司提供。IL-1β的检测采用放免分析法，试剂由北京福瑞生物工程公司提供；酶标仪使用奥地利LABTECH公司生产的ANTHOSHT 11型；计数仪为中国科技大学中佳公司生产的GC300型。
1.3.2提取RNA每位对象于采血前夜22：00后禁食，于早上6：00～7：00抽取静脉血，第二管用PAX gene Blood RNA Tube，采2 ml全血，将采置血管上下颠倒10次。于4℃冰箱24 h内用Taco全自动核酸提取仪提取RNA。经2000 c微量分光光度计检测260/280在1.8～2.0之间，260/230≥1.5。Agilent 2100 Bio analyzer检测，RIN≥7.0，分装后放置-80℃冰箱备用。
1.3.3仪器和试剂盒仪器：美国应用生物系统公司（Applied Bio systems）实时PCR扩增仪Step One PlusTM，由爱普拜斯应用生物系统贸易（上海）有限公司提供。试剂盒：miRcute miRNA提取分离试剂盒、miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒、miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒，均由上海江莱生物科技有限公司提供。所用化学试剂均为分析纯。
1.3.4miRNA-93的表达检测用qRT-PCR法：按miR-cute miRNA（吸附柱法）提取分离试剂盒、miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒、miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒说明书操作。基因引物序列由Prime premier 5.0软件自行设计，由杭州联川生物技术有限公司合成。引物序列如表1。
1.3.5miR-93的相对表达量计算实验以U6snRNA为内参，⊿CT指标的测定：⊿CT指在同一个样品中，目的基因与内参基因平均CT值的差值（CT=miR-93平均CT值-U6平均CT值，2⊿⊿CT表示实验组目的基因表达/对照目的基因表达变化的倍数）。
1.4统计学方法所有数据统计均由 SPSS 17.0 统计软件包完成，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间比较用t检验，miR-93表达水平与TNF-α、sVCAM-1和IL-1β的关系采用线性相关分析，检验水准：α=0.05，双側检验。
2结果
2.1各组TNF-α、sVCAM-1、IL-1β和miR-93水平比较实验组TNF-α、sVCAM-1和IL-1β高于对照组（P<0.001），miR-93表达水平低于对照组（P<0.001）。见表2。
2.2各组不同年龄miR-93水平比较实验组不同年龄miR-93水平均较对照组低（P<0.05或0.01）。见表3、图1。
2.3miR-93表达与TNF-α、sVCAM-1、IL-1β线性相关分析miR-93表达与TNF-α、sVCAM-1、IL-1β水平的相关系数分别为-0.694、-0.621和-0.665，呈负相关，对应r值分别为74.828、54.065、65.627（均P<0.001）。3讨论有机磷中毒患者的胆碱酯酶不能分解乙酰胆碱而导致胆碱能神经支配的器官功能亢进，其临床症状与胆碱能受体的分布、患者生理效应和对炎症的反应有关[5]。研究表明，AOPP迅速使机体发生胆碱能危象、内毒素血症和其他损伤途径等导致内皮功能受损，激活单核巨噬细胞系统，使IL-1β、TNF-α和sVCAM-1炎症因子水平升高[6]，进一步刺激可导致炎症、组织损伤及血管功能障碍。业已证明，IL-lβ、TNF-α及sVCAM-l与AOPP患者的病情和预后有关联[7]。MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长20～25个核苷酸[8]。成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进RNA诱导的沉默复合体，通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。miRNA在细胞分化，生物发育及疾病发生发展过程中的作用，miRNA控制发育开关或组织特异性基因的表达及其机制倍受关注。探讨miRNA和疾病之间的关联性，使其成为疾病诊断、疾病进展与转归的观察指标，对疾病治疗、调控基因表达的分子靶点等都有现实意义，因此miRNA成为临床研究的新热点[9～18]。目前研究表明，miR-93的差异表达在肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移、分化等方面发挥了重要作用，其通过靶向调控靶基因促进细胞的增殖，抑制凋亡[19]。本项研究表明，AOPP不同年龄的患者miR-93呈低表达现象，miR-93表达与TNF-α、sVCAM-1和IL-1β水平呈负相关，miR-93或许参与AOPP的病理生理过程。是否存在相关通路及靶点，使得miR-93表达水平影响TNF-α、sVCAM-1和IL-1β炎症因子水平尚不十分清楚，值得广大临床工作者进一步研究探讨。
参考文献
[1] 陆启峰，梁烨，李天资，等.肿瘤坏死因子α-238 G/A 基因多态性与有机磷中毒中间综合征的关系[J].中国急救医学，2014，34（9）：822-824.
[2] Kavitha N，Vijayarathna S，Jothy SL，et al.MicroRNAs：biogenesis，roles for carcinogenesis and as potential biomarkers for cancer diagnosis and prognosis[J].Asian Pacific Journal of Cancer Prevention Apjcp，2014，15（18）：7489-7497.
[3] 陆启峰，李锦忠，凌永体，等.有机磷中毒中间综合征患者炎症因子变化的研究[J].中国急救医学，2008，28（6）：539-540.
[4] 李鸿翔，李近都，梁烨，等.高血压颈动脉斑块阳性患者miR-375表达检测[J].右江医学，2015，43（1）：16-19.
[5] Bascu n-Gamboa KA，Araya-Quezada M，Pérez-Bravo F.MicroRNAs：an epigenetic tool to study celiac disease[J].Rev Esp Enferm Dig，2014，106（5）：325-333.
[6] Fukaya T，Iwakawa HO，Tomari Y.MicroRNAs block assembly of eIF4F translation initiation complex in Drosophila[J].Mol Cell，2014，56（1）：67-78.
[7] 张近波，许国斌，董美平，等.血液灌流对急性重度有机磷农药中毒患者炎症因子的影响[J].现代实用医学2012，24（1）：11-12，28.
[8] Moura J，Brsheim E，Carvalho E.The Role of MicroRNAs in Diabetic Complications-Special Emphasis on Wound Healing[J].Genes，2014，5（4）：926-56.
[9] 李艳辉，姜兴权，孙宏志，等.IL-6 IL-10及TNF-α在急性有机磷农药中毒引发 MODS中的作用及临床意义[J].中国急救医学，2006，26（11）：804-806.
[10] Pramoolkit P，Lertpanyasampatha M，Viboonjun U，et al.Involvement of ethylene-responsive microRNAs and their targets in increased latex yield in the rubber tree in response to ethylene treatment[J].Plant Physiology & Biochemistry，2014，84：203-212.
[11] 陆启峰，李锦忠，凌永体，等.急性有机磷中毒中间综合征患者纤溶功能的变化[J].广东医学，2008，29（5）：848-849.
[12] Xu Y，Jin H，Yang X，et al.MicroRNA-93 inhibits inflammatory cytokine production in LPS-stimulated murine macrophages by targeting IRAK4[J].Febs Letters，2014，588（9）：1692-1698.
[13] Chuang TD，Luo X，Panda H.miR-93/106b and their host gene，MCM7，are differentially expressed in leiomyomas and functionally target F3 and IL-8[J].Mol Endocrinol，2012，26（6）：1028-1042.
[14] 江洪，梁烨，李近都，等.野芭蕉通络汤治疗对高血压患者miR-375调控的临床观察[J].中药药理与临床，2015，31（2）：103-104.
[15] 何思陆，陆高翔，梁烨，等.铁皮石斛对急性有机磷农药中毒患者解毒及其抗氧化的疗效观察[J].中药药理与临床，2015，31（2）：98-99.
[16] 陆启峰，李天资，梁峰，等.急性有机磷农药中毒病变机制及其中医治疗研究进展[J].中国药物经济学，2013（1）：158-159.
[17] 黄元东，潘兴寿，梁烨，等.铁皮石斛对急性有机磷农药中毒患者解毒及其抗免疫的疗效观察[J].中国地方病防治杂志，2014，29（2）：204.
[18] Fabbri E，Borgatti M，Montagner G，et al.Expression of microRNA-93 and Interleukin-8 during Pseudomonas aeruginosa-mediatedinduction of proinflammatory responses[J].Am J Respir Cell Mol Biol，2014，50（6）：1144-1155.
[19] 劉更，周鸿鹰.miR-93与肿瘤的研究进展[J].四川解剖学杂志，2013，21（3）：28-31.
