摘要：流式细胞术是检测细胞增殖的一种重要手段，较以往的检测方法，流式细胞仪的优点在于能够实现多荧光指标同时检测，并且可以对混合样品中的特定细胞进行增殖分析，本文就目前常用细胞增殖检测染料的检测原理，应用范围及染色方法作进行阐述。
关键词：细胞增殖;流式细胞;DNA染色;示踪染料
中图分类号：R392 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.01.016
文章编号：1006-1959（2019）01-0047-03
Method and Technique for Cell Proliferation by Flow Cytometry
HU Nai-Li
（Central Laboratory，Capital Medical University，Beijing 100069，China）
Abstract：Flow cytometry is an important means to detect cell proliferation. Compared with previous detection methods， flow cytometry has the advantages of simultaneous detection of multiple fluorescence indicators， and can perform proliferation analysis on specific cells in mixed samples. At present， the detection principle， application range and dyeing method of cell proliferation detection dyes are commonly used.
Key words：Cell proliferation;Flow cytometry;DNA staining;Tracer dye
细胞增殖是生物体的重要生命特征，细胞以分裂的方式进行增殖，增殖是生物体生长、发育、繁殖以及遗传的基础，增殖检测技术广泛应用于分子生物学、遗传学、肿瘤生物学、免疫学、药理和药代动力学等研究领域。流式细胞术是一门集现代激光技术、电子技术、生物学技术为一体的高通量细胞检测技术。近年来，得益于激光技术的发展和荧光染料的开发，流式细胞术在已成为检测细胞增殖的一种重要手段，能够快速实现多参数多荧光指标的检测。本文就目前流式细胞检测增殖常用的方法与技术进行阐述。
1基于DNA含量的细胞增殖分析方法
1.1原理 利用某些荧光染料具有与DNA发生特异性结合，且被DNA结合的荧光染料的量与DNA的含量成正比，即荧光强度与荧光直方图的通道数成正比的原理，运用流式细胞仪检测出处于G0/G1期，S期和G2/M期的细胞的比例。根据仪器的不同激光配置及实验需求，有多种荧光染料可供选择。
1.2常用检测法 碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色法：单细胞悬液经通透处理后，加入能够与DNA结合的荧光染料，此时被染荧光物质的量与DNA含量成正比，检测到荧光信号的强度即可代表DNA含量，处于G0/G1期的细胞DNA含量为二倍体，处于G2/M期的细胞DNA含量為四倍体，S期细胞染色体含量介于二倍或四倍之间，所检测的样品中，处于S和G2/M期的细胞越多，说明细胞增殖越活跃。PI可由488 nm或561 nm激发光激发，发射光谱为610～620 nm，由于PI也与双链RNA结合，所以在DNA含量检测前应对样本进行RNase消化处理，排除RNA对DNA荧光定量的影响。目前实验室绝大多数流式细胞仪配备有PI的检测通道，因此PI的应用十分广泛[1-3]。其染色优点为操作简单，可通过一步染色法实现[4]，且CV值小，荧光稳定，抗光漂白性良好。PI在使用过程中最大的限制就其光谱与其它染料的干扰问题，PI与常用染料藻红蛋白（P-phycoerythrin，PE）及PE检测通道的染料光谱几乎是重叠的，因此PI检测周期的样品中不能同时利用PE标记其他指标。若使用488 nm激光器激发PI，PI与异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC），绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）等染料也存在部分光谱重叠。
7-氨基-放线菌素D（7-Aminoactinomycin D，7-AAD）也是标记DNA的染料，主要以插入方式与DNA链的G-C碱基对结合，激发波长约为580 nm，最大发射波长为640 nm。利用流式细胞仪488 nm或561 nm激光器激发均可得到良好的检测效果[5]。7-AAD属细胞膜非通透性染料，不能通过完整的细胞膜，在进行DNA染色前需对细胞进行75%冷乙醇固定处理，由于7-AAD是与DNA特异性结合，因此在染色过程中无需对样品进行RNase处理。7-AAD的发射波长较长，可与PE、FITC等常用流式染料同时使用较少发生光谱重叠。
DAPI和Hoechst33342是常用的DNA标记染料，可以非嵌入方式与DNA链上的A-T碱基对特异性结合，二者光谱较为接近，激发光为355 nm，最大发射光为461 nm，利用流式细胞仪的351 nm紫外激光器激发效果最佳，对于未配备紫外激光器的仪器，405 nm激光器激发也可得到良好的效果[6]。DAPI和Hoechst33342属膜通透性染料，细胞染色DNA无需乙醇固定，活细胞即可，推荐染色工作液浓度均为5～10 mg/ml，避光孵育30 min后上机检测。对于配备有355 nm或405 nm激光器的流式细胞仪而言，利用DAPI和Hoechst33342 染色细胞DNA是良好的选择。首先，二者均使用紫外或紫色激光器激发，与488 nm、561 nm、633 nm检测通道上的荧光染料不存在或较少存在光谱重叠，容易实现细胞的多指标同时检测;其次，由于DAPI和Hoechst33342对细胞膜具有通透性，可以标记活细胞的DNA，因此是两种可应用于活细胞分选的细胞周期染料。
DRAQ5是可发射远红外荧光的蒽醌类染料，激发光谱在很宽范围内，流式细胞仪配备的488 nm、561 nm、633 nm激光器均可对其有效激发，但以633 nm激发效果最佳，DRAQ5具有膜通透，可对活细胞和固定的细胞进行DNA染色分析[7]，由于它主要和DNA双链结合，和RNA的亲和力小，因此染色过程中样本无需RNase消化，利用633 nm激发光，670 nm发射光检测DRAQ5标记细胞周期时，可与FITC、PE、GFP等荧光素同时标记较少发生光谱重叠。
1.3染色的结果分析 以上所介绍的几种染料，激发和发射光谱不同，但染色原理大致相同，都是根据染料的荧光道数与DNA含量成正比这一单一变量检测，因此，只能根据DNA含量区分出G0/G1期，S期和G2/M期，而无法进一步区分出DNA含量相同的G0和G1期，G2和M期。由于处于不同时相的细胞对药物或处理会有不同的反应，因此体外培养的细胞在进行干预前应进行同步化处理，否则会影响实验的重复性。细胞同步化的方法包括、短时间饥饿、照射、低温法、药物抑制等物理或化学方法，血清饥饿法因对细胞本身的干扰小且能够获得大量的G0/G1期细胞因此而最为常用[8-10]。此外，在检测样品的过程中还应注意粘连体细胞的排除，两个2C细胞粘连在一起，在流式细胞仪上检测到的DNA的含量为4C，但由于两个粘连细胞比单个细胞通过激光束的时间长，因此脉冲的宽度是大于单个细胞的，可以利用荧光通道的脉冲宽度信号W的差异进行排除。
对于分析癌变细胞或肿瘤活检组织的DNA含量时，通常引入DNA指数（DI）的概念，即（样品G0/G1期细胞峰的平均荧光道数）/（正常二倍体细胞样品G0/G1期细胞峰的平均荧光道数），理论上正常二倍体细胞DI=1，由于实际检测存在变异系数，实际检测到二倍体DI值为0.9～1.0，四倍体DI值为1.9～2.1，DI值对于临床上肿瘤的诊断具有一定的参考价值。可以使用鸡红细胞或正常人的淋巴细胞作对照来确定二倍体细胞[11]，市面上也有商品化的小鸡红细胞核（CEN）用于调节二倍体峰的位置。DNA含量的检测结果通常利用周期分析软件进行S期划定，一般2C峰和4C峰比较对称，且变异系数CV较小结果比较准确，若CV>8，则无法正确分析出各期细胞比例，目前市面上常用的周期分析软件有Muticycle、ModitLT和Flowjo等，同样样品结果利用不同软件分析各期比例无显著性差异[12]。
2示踪染料标记法
2.1 BrdU和EdU掺入法 5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU），是人工合成的胸腺嘧啶类似物，在DNA合成期（S期），BrdU能够代替胸腺嘧啶而渗入正在复制的DNA分子中，用荧光标记的BrdU抗体进行染色，就可以标记出处于增殖期的细胞，同时结合7-AAD进行DNA染色，可清晰的将细胞区分出G0/G1期，S期和G2/M期[13]。BrdU/7-AAD双参数法的优势在于S期的判定，实验结果无需利用软件分析即可区分各期细胞。在这个方案中，根据所用仪器的激光配置，可选择BrdU与FITC或APC等不同荧光素连接的抗体，7-AAD也可被PI替代。目前BrdU有一大缺点，BrdU抗体分子较大，双链DNA中的碱基对阻碍BrdU与抗体的结合，因此需将DNA双链打开后，若DNA结构打开不充分，BrdU与荧光抗体结合不佳，导致检测到的荧光信号不能真实准确的反映BrdU 的含量，为了能够暴露BrdU的抗原表位，通常用高浓度的盐酸，乙酸或酶解使得DNA变性，但这就破坏了DNA双链结构，影响了其他染料的结合染色，导致染色弥散，准确性降低等问题。5-乙炔基-2"脱氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2"-deoxyuridine，EdU）也是一種胸腺嘧啶核苷类似物，在细胞增殖时能够插入正在复制的DNA分子中，EdU只有BrdU抗体大小的1/500，它与荧光素的结合一种被称作“click”化学作用的Cu+催化的环加成作用，而非抗原抗体反应。与传统的免疫荧光染色比较，Edu反应非常快速，且无需对DNA双链变性，有效地避免了样品损伤，检测细胞增殖具有更高的灵敏度和更快的检测速度，能在组织和细胞水平反映细胞增殖情况[14，15]。
2.2 CFSE标记法 羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（carboxy fluorescein succinimidyl ester，CFSE）是目前应用广泛的一种检测细胞增殖的染料，CFSE的前体羧基荧光二乙酸盐素琥珀酰亚胺酯（carboxy fluorescein diactate succinimidyl ester，CFSE-SE）是没有荧光的，但可自由透过细胞膜进入细胞，进入细胞后，其乙酸基团被胞内酯酶切除后，可产生具有荧光的CFSE，CFSE不可逆地细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上并且长时间存在于细胞内。当细胞进行分裂增殖时，具有荧光的胞质蛋白平均分配到两个第二代细胞中，这样与第一代细胞相比，其荧光强度便会减弱至一半，再次分裂后，第三代细胞的荧光强度会比第二代再减弱一半，以此类推，细胞增殖代数越多，得到细胞的平均荧光强度相比第一代减弱更明显，利用流式细胞仪488 nm激光激发，520 nm接收可检测到细胞CFSE染色荧光，从而反映细胞的增殖情况。
CFSE探针多用于各种干细胞，淋巴细胞的增殖研究中[16，17]，可用于体外培养细胞分裂跟踪，也可用于注入动物器官内观测细胞体内增殖。由于CFSE对细胞是有一定毒性作用的，因此，染色浓度及时间对细胞增殖、分化存在着影响。有研究指出，CFSE对细胞进行染色时呈现浓度依赖型[18]，细胞的荧光随着CFSE 染色终浓度升高而增强，但随着染色浓度的增大，CFSE的细胞毒性也逐渐体现出来，在一定程度上可引起细胞的凋亡，不同种类的细胞CFSE的最佳标记浓度有所区别，最佳的染色浓度是使父代细胞荧光强度比未染色细胞高3～3.5个数量级[19]。CFSE染色的持续时间也很重要，孵育时间过长，可增加细胞毒性[20]，体外培养细胞孵育时间一般控制在10 min内，而后用40%体积的冷小牛血清终止标记10 min后重悬细胞。此外，培养体系或缓冲液中若存在游离氨基酸，会与CFSE结合而影响其染色效果，因此推荐用PBS配制工作液。对于检测结果的分析，可利用ModitLT软件进行增值代数的划定或直接进行细胞平均荧光强度的比较。
3总结
细胞增殖的检测时评估细胞功能的重要实验，相对常用的比色法MTT，CCK-8等，流式细胞术最大的优势在于多色，多参数的检测，可以实现增殖和其他指标的同时检测，或混合样品中特定细胞群体的增殖检测。本文介绍的几种增殖检测试剂，染色原理不同，使用的激光检测通道也有所差异，实验者可根据流式细胞仪激光配置及实验的具体方案进行选择。随着多色流式检测技术的不断发展，从同一份样本获取更多的生物学信息是今后的必然趋势。
参考文献：
[1]Zeng YT，Jiang JM，Lao HY，et al.Antitumor and apoptotic activities of the chemical constituents from the ethyl acetate extract of Artemisia indica[J].Molecular Medicine Reports，2015，11（3）：2234-2240.
[2]Dapena C，Bravo I，Cuadrado A，et al.Nuclear and Cell Morphological Changes during the Cell Cycle and Growth of the Toxic Dinoflagellate Alexandrium minutum[J].Protist，2015，66（1）：146-160.
[3]Uzlikova M，Nohynkova E.The effect of metronidazole on the cell cycle and DNA in metronidazole-susceptible and resistant Giardia cell lines[J].Molecular & Biochemical Parasitology，2014，198（2）：75-81.
[4]柏春玲，廖泽容，张巧，等.应用流式细胞术快速测定细胞周期的DNA一步法[J].昆明医科大学学报，2017，38（2）：10-13.
[5]Carbonari M.New use for an old reagent：Cell cycle analysis of DNA content using flow cytometry in formamide treated cells[J].Cytometry，2016，89（5）：498-503.
[6]户乃丽，徐晓雪，鄒林樾，等.利用405nm激光激发Hoechst33342染色细胞DNA的流式细胞技术[J].现代生物医学进展，2015，15（33）：6406-6409.
[7]Buzina AR，Pinto FE，Nieschke K，et al.Replacement of specific markers for apoptosis and necrosis by nuclear morphology for affordable cytometry[J].Journal of Immunological Methods，2015，420（3）：24-30.
[8]申雪沂，郭佳倩，牛长敏，等.Stra8过表达精原细胞的细胞周期同步化方法的建立[J].中国男科杂志，2017，31（6）：3-7.
[9]Medina-Reyes EI，Bucio-López L，Freyre-Fonseca V，et al.Cell cycle synchronization reveals greater G2/M-phase accumulation of lung epithelial cells exposed to titanium dioxide nanoparticles[J].Environ Sci Pollut Res，2015，22（9）：3976-3982.
[10]Tong J，Sun D，Yang C，et al.Serum starvation and thymidine double blocking achieved efficient cell cycle synchronization and altered the expression of p27， p53， bcl-2 in canine breast cancer cells[J]. Research in Veterinary Science，2016（4）：10-14.
[11]邹林樾，徐晓雪，户乃丽.鸡红细胞标准品在胶质瘤细胞DNA周期检测中的意义[J].继续医学教育，2015，29（10）：152-153.
[12]Massey AJ.Multiparametric Cell Cycle Analysis Using the Operetta High-Content Imager and Harmony Software with PhenoLOGIC[J].PLOS ONE，2015，10（7）：e0134306.
[13]Zhao P，Fu JL，Yao BY，et al.S phase cell percentage normalized BrdU incorporation rate，a new parameter for determining S arrest[J].Biomed Environ Sci，2014，27（3）：215-219.
[14]Harris L，Zalucki O，Piper M.BrdU/EdU dual labeling to determine the cell-cycle dynamics of defined cellular subpopulations[J].Journal of Molecular Histology，2018，49（3）：229-234.
[15]Pereira PD，Serra-Caetano A，Cabrita M，et al.Quantification of cell cycle kinetics by EdU （5-ethynyl-2"-deoxyuridine）-coupled-fluorescence-intensity analysis[J].Oncotarget，2017，8（25）：40514-40532.
[16]Bocharov G，Luzyanina T，Cupovic J，et al.Asymmetry of cell division in CFSE-based lymphocyte proliferation analysis[J].Front Immunol，2013，4（9）：264.
[17]Rodríguez-Pardo VM，Vernot JP.Mesenchymal stem cells promote a primitive phenotype CD34+ c-kit in human cord blood-derived hematopoietic stem cells during ex vivo expansion[J].Cell Mol Biol Lett，2013，18（1）：11-33.
[18]杜振蘭，陈鹏，封志纯.比较不同浓度CFSE荧光标记脐血细胞后存活率的实验研究[J].中华临床医师杂志，2016，10（3）：368-372.
[19]Lyons AB，Blake SJ，Doherty KV.Flow Cytometric Analysis of Cell Division by Dilution of CFSE and Related Dyes[J].Current Protocols in Cytometry，2013（9）：64.
[20]Luzyanina T，Cupovic J，Ludewig B，et al.Mathematical models for CFSE labelled lymphocyte dynamics：asymmetry and time-lag in division[J].Journal of Mathematical Biology，2014，69（6-7）：1547-1583.
