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[摘要] 目的 探討组织激肽释放酶1（KLK1）诱导 大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）向心肌样细胞分化的影响。方法 选取2015年3—7月购买的大鼠BMSCs，将大鼠BMSC细胞分为3组即正常组、组织激肽释放酶1组、5-Aza组。采用RT-PCR分别对诱导培养后的大鼠BMSCs 进行心肌细胞特异性蛋白Actin、c-TnI和Desmin的检测，并用Western blot 免疫印迹分析c-TnT蛋白表达量。 结果 RT-PCR检测显示，5-Aza诱导的BMSCs（1.964±0.805）在心肌特异性蛋白Actin RNA、c-TnI RNA和Desmin RNA的表达均高于空白组（1.000±0.000）（P<0.05）， KLK1诱导组（2.633±0.582）以上蛋白的RNA表达量又显著高于5-Aza诱导组（P<0.05）。Western blot 结果显示，5-Aza诱导组c-TnT蛋白的表达（0.799±0.101）高于空白组（0.112±0.001）（P<0.001），KLK1诱导组（1.294±0.134）显著高于5-Aza组。差异有统计学意义（P<0.001）。结论 5-Aza能有效使BMSCs向心肌样细胞诱导分化，KLK1也能诱导BMSCs向心肌样细胞分化。KLK1较5-Aza诱导的BMSCs在心肌细胞特异性蛋白RNA表达，心肌特异性蛋白T表达其心肌特异性更为突出。
[关键词] 心肌细胞；骨髓间充质干细胞；组织激肽释放酶1；肌动蛋白；结蛋白；肌钙蛋白
[中图分类号] R542 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2017）01（c）-0011-05
Study on Effect of Expression Vector with KLK1 Inducing the BMSCs Cardiac-like Cell Differentiation
WANG Qiu-ping， ZHAO Jing-miao， JIA Jia， LU Juan， HU Ji-hong
Basic Medical College of Gansu Chinese Medical University， Lanzhou， Gansu Province， 730000 China
[Abstract] Objective To study on effect of expression vector with KLK1 inducing the BMSCs cardiac-like cell differentiation. Methods Select the rat BMSC cells from March to July 2015 were divided into the normal group， KLK1 group and 5-Aza group， and the rat BMSCs cells were tested by the cardiac cell specific protein Actin， c-TnI and Desmin by the RT-PCR， and the c-TnT protein expression level was analyzed by the Western blot immunoblotting. Results The RT-PCR test showed that the expression of BMSCs induced by 5-Aza in the myocardial marker protein Actin RNA， c-TnI RNA and Desmin RNA was higher than that in the blank group[（1.964±0.805） vs （1.000±0.000）]（P<0.05）， and the RNA expression level of proteins above the （2.633±0.582） in the KLK1 induction group was obviously higher than that in the 5-Aza induction group（P<0.05）， and the Western blot results showed that the c-TnT protein expression level in the 5-Aza induction group was higher than that in the blank group， [（0.799±0.101） vs （0.112±0.001）]（P<0.001）， and the differences had statistical significance. Conclusion 5-Aza can effectively make the BMSCs cardiac-like cell differentiation， KLK1also can induce the BMSCs cardiac-like cell differentiation， and the cardiac-specificity of KLK1 in the BMSCs induced by the KLK1 cardiac cell specific protein RNA expression and myocardial marker protein T expression is more prominent than induced by the 5-Aza.
[Key words] Cardiac muscle cell； Bone marrow derived mesenchymal stem cell； Tissue kallikrein1； Actin； Desmin； Troponin
目前心血管性疾病成为危害人类健康的主要疾病，其中心肌梗死更是严重威害人类生命。2010年全球冠心病死亡人数占总死亡率15%。药物干预和心脏移植作为当代治疗心脏疾病，改善预后的常用治疗手段仍然存在一定的局限性[1]，干细胞移植作为新兴的细胞生物工程技术已成为研究热点，用以治疗心肌梗死等心血管疾病。骨髓间充质干细胞（Bone Mesenchymal Stem Cells，BMSCs）是具有多系分化，自我更新，和分化增殖潜能的特点，能诱导分化为心肌细胞及其他一些组织细胞在一定条件下。现代医学对骨髓间充质干细胞诱导分化为干细胞进行了大量研究，移植后存活率低而受限[2]。实验研究证明基因修饰可以使骨髓间充质干细胞的生命周期得到显著延长，使其能够继续保持多向分化潜能，更好的向组织细胞分化，以抑制细胞的凋亡、刺激细胞的再生[3-4]KLK1即血管舒缓素，是KLK基因家族中重要的成员，在包括降低血压、抑制心脏和动脉重构、改善胰岛素抵抗、抑制平滑肌细胞增殖及缺血/再灌注损伤起保护作用，而且还有直接舒张血管，抑制凋亡炎症和纤维化，促进血管生成的作用[5]。
因此如何提高骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化率成为研究热点。该实验于2015年3—7月，选择SD大鼠（第2代）组织激肽释放酶1表达载体诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化，以观察其效果。
1 临床资料
选取于骨髓间充质干细胞购自于北京医科利昊生物科技有限公司（SDMSC-3）。DMEM（500 mL）培养基，胎牛血清（500 mL），KLK1腺病毒载体，Trizol，M-MLV，Oligo Dt，Bulge-LoopTM， miRNA qPCR Primer set，Rnase Inhibitor，SYBR Master Mixture，Primer，RatVEGF SunnyELISA。仪器：Nanodrop 分光广度计，稳压电泳仪，超细匀浆机，Real time PCR 仪器，反转录耗材，CO2恒温培养箱
2 实验方法
2.1 SD大鼠骨髓间充质干细胞培养
常规灭菌，打开培养瓶，放入细胞，根据细胞的生长情况加入培养基（80%～90%）和血清（10%～20%），放入37℃，5%CO2培养箱中，次日观察细胞生长状态，是否需要换液。换液取细胞培养瓶，弃液，用酒精灯消毒；用PBS冲洗1次，再弃液，灭菌，加入培养基，镜下观察细胞，后放入培养箱，根据细胞生长情况，每隔2～3 d进行观察换液。细胞生长至80%～90%融合时可传代。在重大疾病分子医学与中医药防治研究省级重点实验室进行实验，选取于2015年3—7月。
2.2 SD大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导
将第2代SD大鼠骨髓间充质干细胞复苏传代，将传代后的细胞随机分组为3组：BMSCs组（正常组），KLK1组，5-Aza组。诱导组分别加入含5-Aza和含KLK1细胞因子的诱导液，进行诱导分化培养，诱导24 h后，更换完全培养液继续培养，每3 d换液1次，并收集细胞培养上清液，放于-20℃保存，连续4周后，对分化的细胞进行鉴定。
2.3 Real-time qPCR检测心肌相关蛋白Desmin、ɑ-sarcomeric actin、cardiac Troponin I（cTn I）mRNA的表达
总RNA抽提收集细胞，2 000 rpm离心5 min，去上清，细胞沉淀中加入1 mL Trizol，充分混匀后室温静止5 min，然后转移至新的1.5 mL EP管中，MicroRNA 反轉录。反转录：将2 μL 反转录引物（0.5 μg/μL）和2.0 μg Total RNA加入到PCR小管中，补RNase-free water至11 μL；混匀后离心，70℃温浴10 min；之后立即至于冰水混合物中冰浴，使反转录引物和模板退火。RNA反转录将1 μL Oligo Dt（0.5 μg/μL）和2.0 μg Total RNA加入到PCR小管中，补充RNase-free H2O至10 μL；混匀后离心，70℃温浴10 min；之后立即置于冰水混合物中冰浴，使Oligo dT和模板退火。在上述混合物中，按以下的比例配制反应体系（冰上进行），混匀，短暂离心。将得到的RT产物—cDNA置于-20℃保存备用。Real-time PCR检测引物序列如表1所示。
2.4 c-TnT蛋白 Western blot 免疫印迹分析
提取细胞蛋白，从培养箱中取出细胞弃液，用PBS冲2次弃液，加入适量蛋白电泳，吹打细胞至充分裂解，移入EP管冰上裂解10～15 min，4℃，12 000 g离心5 min，放入沸水水浴10 min，4℃，12 000 g离心1 min，-80℃备用。聚丙稀酰胺凝胶电泳：利用BioRad Protean Ⅲ装置制备长7.00 cm、厚0.75 mm的胶，分离做成梯度胶，分3层，底层铺满后应立即铺上2层，以使3层胶融为一体。各层缓冲液浓度相同，均为0.375 mol/L的 Tris-HCl buffer （pH 8.8）+ 2 g/L的SDS。制备过程中，底层、中层、上层分别加入体积分数为0.1、0.075、0.03的甘油以增加稳定性。胶凝后每孔上样约200 μg， 预染的顺序为空白组，KLK1组，5-Aza组。将蛋白质样品，室温下100 V恒压电泳4 h，电泳缓冲液含14.4 g/L的甘氨酸，3 g/L 的 Tris及2g/L 的 SDS。进行转膜工作并观察转膜情况。c-TnT蛋白Western blot 免疫印迹分析：转膜后封闭液封闭1 h，留置待用。TBST洗膜后，发光剂孵育 1 min，暗室曝光，图像扫描进行Western blot免疫印迹分析。另配置120 g/L 的分离胶， 按传统方法做内参 GAPDH 的 Western blot 免疫印迹。
3 统计方法
应用SPSS 19.0统计学软件对数据进行分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示服从正态分布，组间比较采用方差分析，LSD两两比较做进一步分析，检验水准为P<0.05；中位数和四分位间距表达用于不服从正态分布，组间比较采用秩和检验。计数资料用率（%）表达，组间比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
4 结果
4.1 RT-PCR检测诱导后BMSCs心肌早期基因的表达
经5-Aza诱导的BMSCs在心肌特异性蛋白Actin RNA、c-TnI RNA的表达和Desmin RNA的表达与空白组比较差异有统计学意义（P<0.05）。经KLK1诱导的BMSCs在心肌特异性蛋白Actin RNA、c-TnI RNA和Desmin RNA的表达比较差异有统计学意义（P<0.05）。KLK1诱导组与5-Aza诱导组比较在心肌特异性蛋白Actin RNA，c-TnI RNA，Desmin RNA的表达增高，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。
4.2 c-TnT蛋白 Western blot 免疫印迹分析的表达结果
经5-Aza诱导的BMSCs在c-TnT蛋白的表达与空白组比较，差异有统计学意义（P<0.001）。经KLK1诱导的BMSCs在c-TnT蛋白的表达与正常组比较，差异有统计学意义（P<0.001）。KLK1组与5-Aza组比较其表达增高，见表2。
4.3 c-TnT蛋白 Western blot 免疫印迹内参灰度表达
图1为c-TnT蛋白 Western blot 免疫印迹内参灰度表达，图2 为3组实验组c-TnT蛋白 Western blot 免疫印迹灰度表达，用目的条带的灰度值比内参GAPDH灰度值代表蛋白相对表达量，采用ImagJ软件进行灰度值的计算。
5 讨论
心肌梗死后，如何修复坏死心肌、改善心功能，是心梗治疗的关键。目前，对于心肌梗死的治疗方法有药物治疗、介入治疗、手术治疗等，这些治疗方法也只能恢复再灌注，而不能修复或逆转已坏死的心肌。骨髓间充质干细胞是骨髓基质中存在的非造血系的成体干细胞，具有向多种细胞分化的能力，可向包括血管内皮细胞、心肌细胞、骨细胞、神经细胞等分化，除此外还有自我更新能力、可塑性高、易导入外源基因等特点，因此BMSCs是基因治疗的理想供体细胞[6]。基于已有大量体外实验研究旨在通过加入适当的诱导剂，使BMSCs定向分化为心肌样细胞。选择安全有效的诱导剂并将BMSCs高效诱导为心肌细胞，则是干细胞移植治疗成功的关键，也是为日后体内移植实验研究做基础。
5-氮杂胞苷（5-azaCytidine，5-Aza）是一种DNA转甲酶抑制剂，实验证明其可使干细胞向心肌样细胞分化，成为诱导的较理想途径，还是衡量其他诱导条件有效性的标准，但对细胞有一定的毒性作用，其浓度大小会对BMSCs分化为心肌样细胞产生影响。低浓度的5-Aza分化效率较低，但浓度过高又造成细胞大量死亡。由于5-Aza对BMSCs诱导其浓度难以掌握，同时诱导后的细胞活性也受影响，有研究表明常规剂量5-Aza能诱导BMSCs凋亡[7]。
基因修饰可以使骨髓间充质干细胞的生命周期得到显著延长，使其能够继续保持多向分化潜能，有研究发现经基因修饰的BMSC可促进其向心肌样细胞的分化[8-9]。KLK1转染BMSC向心肌样细胞分化方面在国内外尚无报道。KLK1在心血管的表达及作用是通过缓激肽或赖氨酰缓激肽来调节的。已有研究表明KLK1與心脏疾病有重要关系。在心脏疾病发生过程中，活性激肽的减少导致心肌储备力下降，而KLK1能特异性的在碳末端切割底物肽，可裂解激肽原释放具有活性的激肽，增强心肌储备力，从而能发挥对心血管系统的调节作用。
该实验将大鼠BMSCs细胞分别进行5-Aza和KLK1转染，RT-PCR检测结果显示，经5-Aza诱导的BMSCs在心肌特异性蛋白Actin RNA、c-TnI RNA和Desmin RNA的表达均高于空白组，5-Aza组为（1.964±0.805）、（0.716±0.074）、（109.2±5.744）。空白组为（1.000±0.000）；KLK1诱导组以上蛋白的RNA表达量又显著高于5-Aza诱导组，KLK1组为（2.633±0.582）、（0.732±0.0492）、（223.894±0.895）。Western blot 免疫印迹结果显示5-Aza诱导组c-TnT蛋白的表达高于空白组（P<0.001），5-Aza组为（0.799±0.101），空白组为（0.112±0.001），KLK1诱导组显著高于5-Aza组（P<0.001），KLK1组为（1.294±0.134）。a-Actin是心肌细胞的肌动蛋白的主要存在形式。结蛋白（Desmin）被认为是前体肌细胞活化的早期标志物，参与肌细胞的形成是通过其肌纤维结构形成时发挥作用。肌钙蛋白cTnT作为心肌细胞内的一种特异性结构蛋白，在心肌发育过程中，cTnT的表达发生一系列的变化参与组成细肌丝，并与心肌收缩和舒张的调节有关。由于以上蛋白在心肌细胞形成早期所具有的一定特殊代表性，也是BMCs分化为心肌细胞后进行收缩的重要结构基础。该研究结果表明KLK1对BMSCs有向心肌样细胞的分化作用，而且KLK1诱导分化率较5-Aza高，相对5-Aza更安全。有研究将心肌细胞与BMSCs按一定比例共培养，也可使BMSCs向心肌细胞分化，其PCR检测PCR 检测各组均有cTnT表达为（14.79±0.110）[10]。
该实验是对KLK1干预BMSCs向心肌样细胞分化是否有效的初步判断，并未对诱导后的细胞没有进行相关的心肌样搏动相关因子的检测，如免疫荧光和RT-PCR检测细胞起搏基因HCN2和HCN4。或是通过在电镜下观察其超微结构来判断是否有心肌样变化，还有待进一步验证。
随着心血管疾病发病率日益增加，对心血管疾病的治疗不仅局限于药物，手术治疗，心脏移植治疗等，从种子细胞即干细胞移植层面研究治疗已收到广泛关注。因为常规治疗方法并不能从根本治疗坏死的心肌细胞，而心脏移植对于大多数患者来说费用昂贵且没有大量的移植源可提供。该实验的目的在于找到更安全，有效的BMSCs向心肌样细胞分化的诱导剂，为BMSCs向心肌样细胞分化并向体内移植治疗心肌梗死，亦为日后心血管疾病的临床治疗提供基础层面的支持。
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