材料与方法
1.1供试材料
采自黑龙江省哈尔滨市不同田块的野慈姑种群（Sagittaria trifolia L.）见表1。各种群分别取植株幼嫩部分，冻存于-80 ℃。
1.2试验方法
1.2.1整株生测法选取4～6叶期长势均匀的野慈姑，进行喷雾处理。试验按照表2设计用量处理，每处理重复4次。喷药后放在暗处吸收6 h，然后光暗交替12 h继续培养。
1.2.2野慈姑ALS基因扩增引物的设计与合成根据已发表的野慈姑ALS基因序列（AB301496.1），设计并于生工生物工程（上海）股份有限公司合成正反向2条引物（表3）。
1.2.3野慈姑ALS基因片段的克隆及测序对目的条带切胶回收、纯化后连接到pMD18-T载体，然后转到大肠杆菌感受态细胞中。将菌液均匀涂布于含有Ampicilin和X-gal/IPTG的LB固体培养基上，37 ℃过夜培养。从培养基上挑取15个白色单菌落到含Ampicilin的LB培养液中，以200 r/min的速度在37 ℃摇床内振荡培养5 h，然后以菌液为模板进行转化鉴定。25 μL的菌液PCR组分包括9.5 μL ddH2O、12.5 μL 2×Pfu PCR MasterMix（TIANGEN公司）、1 μL菌液、上下游引物各1 μL（10 μmol/L）。挑选其中至少5个阳性克隆送公司双向测序，引物为通用引物M13。
1.2.4生物学信息分析用DNAMAN V6软件对试验反枝苋种群ALS基因片段的测序结果进行比对，寻找6个突变位点的差异性。
2结果与分析
2.1生物测定结果及分析
施药7 d后，调查吡嘧磺隆对各野慈姑样本地上鲜质量的抑制差异。随吡嘧磺隆剂量的升高，对8个样本的抑制率增强。其中样本N03和N06抗性水平较高，4倍剂量时的生长抑制率低于50%，即对吡嘧磺隆抗性达到4倍剂量以上（表4）。对这2个野慈姑抗性种群和敏感种群进行ALS基因片段的生物信息学分析。
2.2野慈姑基因组DNA的提取及目的片段扩增
3种野慈姑取幼嫩组织在液氮中研磨成细粉，使用快捷型植物基因组DNA提取系统，对基因组DNA进行提取，电泳检测提取成功（图1）。
[FK（W9][TPLY1.tif]
PCR反应条件为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s、59 ℃退火30 s、72 ℃延伸2 min，共进行33 次循环；72 ℃延伸10 min。扩增产物点样于1%琼脂糖凝胶中进行电泳检测，扩增成功（图2）。
2.3野慈姑ALS基因片段的生物信息学分析
对3个野慈姑种群的ALS测序片段进行比对后发现，抗性种群N03和N06在Pro197位发生了导致不同氨基酸发生取代的突变。其中，N03由CCC突
3讨论与结论
本试验通过整株生物测定法，对采自8个地块野慈姑的抗药性水平进行了检测，发现有2个地块的野慈姑对吡嘧磺隆的敏感性降低，抗性达到4倍剂量以上。对靶标酶ALS的部分基因片段进行扩增、克隆、测序后发现，2个抗性种群——N03、N06靶标酶ALS的高度保守区域Domain A发生了基因突变，197位由CCC分别突变为CTC/CCC、TCC，分别导致脯氨酸被亮氨酸、丝氨酸取代。突变的发生可能是导致野慈姑对磺酰脲类除草剂产生抗性的重要原因之一。
基于靶标位点突变的ALS抑制剂抗性是杂草产生抗性的重要机制，通常是由于ALS的编码基因保守区域发生突变，导致单个氨基酸被取代[14-15]，这种取代也可在多个位点同时发生。在过去20年里，全球范围内在50个杂草种群中，共发现8个能够导致抗性产生的突变位点以及26种氨基酸替代方式[16]。目前野慈姑的靶标位点抗性情况已有报道，2014年日本Iwakami等发现了发生CCC/TCC杂合突变的野慈姑种群，本研究发现的2种突变方式尚未报道。
非靶标位点导致的除草剂抗性原理较复杂，可能由除草剂代谢机制的增强或解毒酶（P450解毒酶，GSTs等）活性提高引起[12，17]。本次试验未对非靶标方面机理进行研究，因此不能排除其对抗性产生的贡献，这有待进一步证实。
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